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果蠅卵巢生殖干細胞（germline stem cell，簡稱GSC）是干細胞生物學研究的理想模型【1】，其增殖與分化受細胞內在調控因子和微環境信號共同作用。許多參與調控GSC的內源基因與哺乳動物干細胞發育相關基因，在功能上具有很高的同源性。野生型果蠅卵巢是由32-40個卵巢小管構成，每個卵巢小管的生殖腺前端僅有2-3個GSC。由于野生型果蠅卵巢GSC數量稀少，在單細胞水平分離、純化GSC，構建生殖細胞圖譜和研究GSC細胞特異轉錄特征變得困難重重。

2023年8月21日，華南農業大學植物保護學院鐘國華教授團隊在EMBO Reports上發表了題為Single-cell RNA sequencing identifies eggplant as a regulator of germ cell development in Drosophila的研究成果。

研究人員首先利用單細胞轉錄組測序（scRNA-seq）對野生型果蠅卵巢進行研究，分析得到24個不同細胞亞群的單細胞轉錄組圖譜。結合marker基因表達模式和擬時序分析，進一步對生殖細胞群進行合并和篩選，最終獲得6類生殖細胞亞群：GSC、未分化生殖細胞群-1、未分化生殖細胞群-2、早期滋養細胞，卵細胞和末期滋養細胞。利用生信分析（SCENIC分析、GO/KEGG富集分析）和RNAi篩選，構建GSC維持和分化的潛在基因調控網絡。隨后，作者利用原位雜交和免疫組化實驗，鑒定出9個新GSC特異表達marker基因和1個合胞體（cyst）標記基因。研究發現，在轉錄和蛋白水平上，eggplant（eggpl）特異表達于早期未分化生殖細胞（GSC/CB）中, 并且主要在GSC中高表達。有趣的是，eggpl在幼蟲和成蟲階段的雌/雄蟲生殖腺前端也高表達。功能上，eggplRNAi或純合突變引起的基因表達下調，會顯著增加2-cell，4-cell，8-cell cysts數量并加速這些細胞的細胞周期。eggpl表達下調能夠顯著促進卵子形成，導致卵巢體積增大。這些結果表明，eggpl對調控早期生殖細胞分化具有重要意義。富含酵母的培養條件下，果蠅卵巢eggpl表達量顯著降低，cysts細胞的細胞周期速率顯著增加，卵巢體積也顯著增加（圖1）。因此，推測eggpl可能是一種參與營養信號轉導的生殖細胞內在信號分子。

（圖1）不同營養條件對eggpl表達量，cysts細胞周期和卵巢發育的影響

為了驗證eggpl是否參與Insulin信號通路調節GSC增殖分化，研究人員利用Gal4/UAS系統特異驅動Dp110CA或Dp110DN進而調節PI3K（一種Insulin信號正調節因子）在生殖細胞的活性。研究發現，過表達Dp110CA能夠顯著增加BrdU+cysts細胞數，此結果與在富含酵母的培養條件下，果蠅卵巢cysts細胞表型一致。然而，過表達Dp110DN能夠顯著減少BrdU+cysts細胞數。有趣的是，eggpl下調表達能夠抑制過表達Dp110DN引起的BrdU+cysts減少。這些結果表明，eggpl可能是PI3K的下游調控因子。與此同時，研究還發現，不論在富含酵母的培養條件下或標準培養條件下，過表達Dp110DN均能顯著增加Eggpl的蛋白表達量，而過表達Dp110CA均能顯著減少Eggpl的蛋白表達量。綜上所述，eggpl作為Insulin信號通路的下游調控因子參與調控GSC增殖分化過程（圖2）。

（圖2）PI3K調節eggpl表達驗證及eggpl調控GSC分化模式圖

本研究的意義：1.揭示了果蠅卵巢早期生殖細胞系在單細胞轉錄水平的分化發育特點，分析獲得的GSC單細胞轉錄組數據為生殖細胞生物學研究提供重要參考資源；2.首次報道eggpl的表達模式和eggpl突變卵巢表型特征，創新性提出eggpl可能作為Insulin通路下游靶標因子參與調節GSC分化的新模式。

本論文工作主要由華南農業大學植物保護學院博士研究生孫智鵬（論文第一作者）完成，加州大學舊金山分校醫學院Todd. Nystul教授和華南農業大學植物保護學院鐘國華教授為論文共同通訊作者。

原文鏈接：https://doi.org/10.15252/embr.202256475

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